Proizvodi
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR komplet za detekciju 2019-nCoV
Očekivana upotreba
Ovaj se komplet koristi za kvalitativno otkrivanje novog koronavirusa (2019-nCoV) pomoću briseva grla, nazofaringealnih briseva, bronhoalveolarne lavažne tekućine i sputuma. Rezultat otkrivanja ovog proizvoda služi samo za kliničku referencu i ne smije se koristiti kao jedini dokaz za kliničku dijagnozu i liječenje. Preporučuje se sveobuhvatna analiza stanja u kombinaciji s kliničkim manifestacijama pacijenta i drugim laboratorijskim testovima.
Princip inspekcije
Komplet se temelji na jednostepenoj RT-PCR tehnologiji. Zapravo, geni ORF1ab i N novog koronavirusa (2019-nCoV) iz 2019. godine odabrani su kao ciljne regije amplifikacije. Specifični primeri i fluorescentne probe (probe N gena označene su s FAM, a probe ORF1ab označene su s HEX) dizajnirani su za detekciju RNA novog tipa koronavirusa iz 2019. godine u uzorcima. Komplet također uključuje endogeni sustav za detekciju interne kontrole (proba gena interne kontrole označena s CY5) za praćenje procesa prikupljanja uzoraka, amplifikacije RNA i PCR-a, čime se smanjuju lažno negativni rezultati.
Glavne komponente
| Komponente | Volumen(48T/Komplet） |
| RT-PCR reakcijska otopina | 96 µl |
| nCOV početnica TaqMan mješavina sonde（ORF1ab, N gen, RnaseP gen） | 864 µl |
| Negativna kontrola | 1500 µl |
| nCOV pozitivna kontrola（l ORF1ab N gen） | 1500 µl |
Vlastiti reagensi: reagensi za ekstrakciju ili pročišćavanje RNA. Negativna/pozitivna kontrola: Pozitivna kontrola je RNA koja sadrži ciljni fragment, dok je negativna kontrola voda bez nukleinskih kiselina. Tijekom upotrebe trebaju sudjelovati u ekstrakciji i trebaju se smatrati zaraznima. S njima treba rukovati i zbrinuti ih u skladu s relevantnim propisima.
Interni referentni gen je ljudski gen RnaseP.
Uvjeti skladištenja i rok trajanja
-20±5℃, izbjegavati ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje više od 5 puta, vrijedi 6 mjeseci.
Primjenjivi instrument
S FAM / HEX / CY5 i drugim višekanalnim fluorescentnim PCR instrumentom.
Zahtjevi za uzorke
1. Primjenjive vrste uzoraka: brisevi grla, brisevi nazofarinksa, tekućina bronhoalveolarne lavaže, sputum.
2. Uzimanje uzoraka (aseptična tehnika)
Faringealni bris: Obrišite krajnike i stražnju stijenku ždrijela s dva brisa istovremeno, a zatim uronite glavu brisa u epruvetu koja sadrži otopinu za uzorkovanje.
Sputum: Nakon što pacijent duboko kašlje, prikupite iskašljani sputum u epruvetu s navojnim čepom koja sadrži otopinu za uzorkovanje; tekućina za bronhoalveolarnu lavažu: Uzorkovanje provode medicinski stručnjaci. 3. Skladištenje i transport uzoraka
Uzorke za izolaciju virusa i testiranje RNA treba testirati što je prije moguće. Uzorke koji se mogu otkriti unutar 24 sata mogu se čuvati na 4 ℃; one koji se ne mogu otkriti unutar 24 sata
sati treba čuvati na -70℃ ili niže (ako nema uvjeta skladištenja od -70℃, treba ih čuvati
privremeno pohranjeno u hladnjaku na -20℃). Uzorke treba izbjegavati ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje tijekom transporta. Uzorke treba poslati u laboratorij što je prije moguće nakon prikupljanja. Ako se uzorci trebaju transportirati na velike udaljenosti, preporučuje se skladištenje u suhom ledu.
Metode ispitivanja
1 Obrada uzorka i ekstrakcija RNA (područje obrade uzorka)
Preporučuje se uzeti 200 μl tekućeg uzorka za ekstrakciju RNA. Za povezane korake ekstrakcije pogledajte upute komercijalnih kompleta za ekstrakciju RNA. I negativni i negativni
Kontrole u ovom kompletu bile su uključene u ekstrakciju.
2 Priprema PCR reagensa (prostor za pripremu reagensa)
2.1 Izvadite sve komponente iz kompleta, odmrznite ih i promiješajte na sobnoj temperaturi. Prije upotrebe centrifugirajte na 8000 okretaja u minuti nekoliko sekundi; izračunajte potrebnu količinu reagensa i reakcijski sustav pripremite kako je prikazano u sljedećoj tablici:
| Komponente | N porcija (sustav od 25 µl) |
| nCOV primer TaqMan mješavina sonde | 18 µl × N |
| RT-PCR reakcijska otopina | 2 µl × N |
| *N = broj testiranih uzoraka + 1 (negativna kontrola) + 1 (nCOVpozitivna kontrola) | |
2.2 Nakon temeljitog miješanja komponenti, kratko centrifugirajte kako bi sva tekućina sa stijenke epruvete pala na dno epruvete, a zatim alikvotirajte 20 µl sustava za amplifikaciju u PCR epruvetu.
3 Uzorkovanje (prostor za pripremu uzoraka)
Nakon ekstrakcije dodajte 5 μl negativne i pozitivne kontrole. RNA uzorka koji se testira dodaje se u PCR reakcijsku epruvetu.
Čvrsto zatvorite epruvetu i centrifugirajte je na 8000 okretaja u minuti nekoliko sekundi prije nego što je prenesete u područje detekcije amplifikacije.
4 PCR amplifikacija (amplificirano područje detekcije)
4.1 Stavite reakcijsku epruvetu u ćeliju za uzorak instrumenta i postavite parametre na sljedeći način:
| pozornica | Ciklus broj | Temperatura(°C) | Vrijeme | kolekcijastranica |
| Obrnutotranskripcija | 1 | 42 | 10 minuta | - |
| Preddenaturacijan | 1 | 95 | 1 minuta | - |
| Ciklus | 45 | 95 | 15 sekundi | - |
| 60 | 30-ih | prikupljanje podataka |
Odabir kanala za detekciju instrumenta: Odaberite FAM, HEX, CY5 kanal za fluorescentni signal. Za referentni fluorescentni NONE, nemojte odabrati ROX.
5 Analiza rezultata (Molimo pogledajte upute za svaki instrument za eksperiment za podešavanje)
Nakon reakcije, spremite rezultate. Nakon analize, prilagodite početnu vrijednost, završnu vrijednost i graničnu vrijednost osnovne linije prema slici (korisnik može prilagoditi prema stvarnoj situaciji, početna vrijednost može se postaviti na 3~15, završna vrijednost može se postaviti na 5~20, podešavanje) u logaritamskom grafu. Na pragu prozora, linija praga je u logaritamskoj fazi, a krivulja amplifikacije negativne kontrole je ravna linija ili ispod linije praga.
6. Kontrola kvalitete (u test je uključena i proceduralna kontrola). Negativna kontrola: Nema očite krivulje amplifikacije za FAM, HEX, CY5 kanale detekcije.
COV pozitivna kontrola: očita krivulja amplifikacije FAM i HEX kanala za detekciju, Ct vrijednost ≤ 32, ali nema krivulje amplifikacije CY5 kanala;
Gore navedeni zahtjevi moraju biti ispunjeni istovremeno u istom eksperimentu; u suprotnom, eksperiment je nevažeći i potrebno ga je ponoviti.
7 Određivanje rezultata.
7.1 Ako nema krivulje amplifikacije ili je Ct vrijednost > 40 u FAM i HEX kanalima testnog uzorka, a postoji krivulja amplifikacije u CY5 kanalu, može se procijeniti da u uzorku nema RNA novog koronavirusa iz 2019. (2019-nCoV);
.2 Ako testni uzorak ima očite krivulje amplifikacije u FAM i HEX kanalima, a Ct vrijednost je ≤40, može se procijeniti da je uzorak pozitivan na novi koronavirus iz 2019. (2019-nCoV).
7.3 Ako testni uzorak ima jasnu krivulju amplifikacije samo u jednom kanalu FAM-a ili HEX-a, a Ct vrijednost je ≤40, a u drugom kanalu nema krivulje amplifikacije, rezultate je potrebno ponovno testirati. Ako su rezultati ponovnog testiranja konzistentni, uzorak se može smatrati pozitivnim za novi
koronavirus 2019 (2019-nCoV). Ako je rezultat ponovnog testiranja negativan, može se procijeniti da je uzorak negativan na novi koronavirus 2019 (2019-nCoV).
Pozitivna vrijednost prosudbe
Metoda ROC krivulje koristi se za određivanje referentne CT vrijednosti kompleta, a referentna vrijednost interne kontrole je 40.
Tumačenje rezultata ispitivanja
1. Svaki eksperiment treba testirati na negativne i pozitivne kontrole. Rezultati ispitivanja mogu se utvrditi samo kada kontrole zadovoljavaju zahtjeve kontrole kvalitete.
2. Kada su FAM i HEX detekcijski kanali pozitivni, rezultat s CY5 kanala (kanal unutarnje kontrole) može biti negativan zbog konkurencije sustava.
3. Kada je rezultat interne kontrole negativan, ako su i FAM i HEX detekcijski kanali epruvete također negativni, to znači da je sustav onemogućen ili da je rad pogrešan, tj. test je nevažeći. Stoga je uzorke potrebno ponovno testirati.
