Proizvodi
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR komplet za otkrivanje za 2019-nCoV
Očekivana upotreba
Ovaj pribor se koristi za kvalitativno otkrivanje novog koronavirusa (2019-nCoV) pomoću briseva grla, nazofaringealnih briseva, bronhoalveolarne tekućine za ispiranje, sputuma. Rezultat detekcije ovog proizvoda služi samo za kliničku referencu i ne smije se koristiti kao jedini dokaz za kliničku dijagnozu i liječenje. Preporuča se opsežna analiza stanja u kombinaciji s kliničkim manifestacijama bolesnika i drugim laboratorijskim pretragama.
Načelo inspekcije
Komplet se temelji na RT-PCR tehnologiji u jednom koraku.Zapravo, geni ORF1ab i N novog koronavirusa (2019-nCoV) iz 2019. odabrani su kao ciljna područja pojačanja.Specifični primeri i fluorescentne sonde (probe N gena označene su s FAM, a ORF1ab sonde su označene s HEX) dizajnirane su za otkrivanje RNK novog tipa koronavirusa 2019. u uzorcima.Komplet također uključuje sustav detekcije endogene unutarnje kontrole (sonda internog kontrolnog gena označena s CY5) za praćenje procesa prikupljanja uzorka, RNA i PCR amplifikacije, čime se smanjuju lažno negativni rezultati.
Glavne komponente
| Komponente | Volumen（48T/komplet） |
| RT-PCR reakcijska otopina | 96 µl |
| nCOV početnica TaqMan mješavina sonde（ORF1ab, N gen, RnaseP gen） | 864 ul |
| Negativna kontrola | 1500µl |
| nCOV pozitivna kontrola（l ORF1ab N gen） | 1500µl |
Vlastiti reagensi: RNA ekstrakcija ili reagensi za pročišćavanje.Negativna/pozitivna kontrola: Pozitivna kontrola je RNA koja sadrži ciljni fragment, dok je negativna kontrola voda bez nukleinske kiseline.Tijekom upotrebe trebaju sudjelovati u ekstrakciji i treba ih smatrati zaraznima.S njima treba postupati i treba ih zbrinuti u skladu s relevantnim propisima.
Interni referentni gen je ljudski gen RnaseP.
Uvjeti skladištenja i rok trajanja
-20±5℃, izbjegavajte ponovno zamrzavanje i odmrzavanje više od 5 puta, vrijedi 6 mjeseci.
Primjenjivi instrument
S FAM / HEX / CY5 i drugim višekanalnim fluorescentnim PCR instrumentom.
Zahtjevi za uzorke
1. Primjenjive vrste uzoraka: brisevi grla, nazofaringealni brisevi, bronhoalveolarna tekućina za ispiranje, sputum.
2. Prikupljanje uzoraka (aseptična tehnika)
Bris ždrijela: obrišite krajnike i stražnju stijenku ždrijela s dva tupfera istovremeno, zatim uronite glavu brisa u epruvetu koja sadrži otopinu za uzorkovanje
Sputum: Nakon što pacijent duboko zakašlje, sakupite iskašljani sputum u epruvetu s navojnim čepom koja sadrži otopinu za uzorkovanje;bronhoalveolarna tekućina za ispiranje: uzorkovanje od strane medicinskih stručnjaka.3.Skladištenje i transport uzoraka
Uzorke za izolaciju virusa i RNA testiranje treba testirati što je prije moguće.Uzorci koji se mogu otkriti unutar 24 sata mogu se pohraniti na 4 ℃;one koje se ne mogu otkriti unutar 24
sati trebaju biti pohranjeni na -70 ℃ ili niže (ako ne postoje uvjeti skladištenja na -70 ℃, trebaju biti
privremeno pohranjeno na -20 ℃ u hladnjaku).Uzorke treba izbjegavati opetovano zamrzavanje i odmrzavanje tijekom transporta.Uzorke treba poslati u laboratorij što je prije moguće nakon uzimanja.Ako se uzorci moraju transportirati na velike udaljenosti, preporučuje se skladištenje suhog leda.
Metode ispitivanja
1 Obrada uzorka i ekstrakcija RNK (područje obrade uzorka)
Preporuča se uzeti 200 μl tekućeg uzorka za ekstrakciju RNA.Za povezane korake ekstrakcije pogledajte upute komercijalnih kompleta za ekstrakciju RNK.I ono negativno i negativno
kontrole u ovom kompletu bile su uključene u ekstrakciju.
2 Priprema reagensa za PCR (područje za pripremu reagensa)
2.1 Izvadite sve komponente iz kompleta i otopite i pomiješajte na sobnoj temperaturi.Centrifugirajte na 8000 okretaja u minuti nekoliko sekundi prije upotrebe;izračunajte potrebnu količinu reagensa, a reakcijski sustav je pripremljen kako je prikazano u sljedećoj tablici:
| Komponente | N posluživanje (25µl sustav) |
| nCOV primer TaqMan mješavina sonde | 18 µl × N |
| RT-PCR reakcijska otopina | 2 µl × N |
| *N = broj testiranih uzoraka + 1 (negativna kontrola) + 1 (nCOVpozitivna kontrola) | |
2.2 Nakon temeljitog miješanja komponenata, kratko vrijeme centrifugirajte kako bi sva tekućina sa stijenke epruvete pala na dno epruvete, a zatim alikvotirajte sustav za pojačanje od 20 µl u epruvetu za PCR.
3 Uzorkovanje (područje pripreme uzorka)
Dodajte 5 μl negativne i pozitivne kontrole nakon ekstrakcije.RNK uzorka koji se testira dodaje se u PCR reakcijsku epruvetu.
Čvrsto zatvorite epruvetu i centrifugirajte na 8000 okretaja u minuti nekoliko sekundi prije nego što je prebacite u područje detekcije pojačanja.
4 PCR amplifikacija (pojačano područje detekcije)
4.1 Postavite reakcijsku epruvetu u ćeliju za uzorke instrumenta i postavite parametre kako slijedi:
| pozornici | Ciklus broj | Temperatura(°C) | Vrijeme | kolekcijamjesto |
| Obrnutotranskripcija | 1 | 42 | 10 min | - |
| Preddenaturacijan | 1 | 95 | 1 minuta | - |
| Ciklus | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30-te godine | prikupljanje podataka |
Odabir kanala detekcije instrumenta: Odaberite FAM、HEX、CY5 kanal za fluorescentni signal.Za referencu fluorescentno NEMA, nemojte odabrati ROX.
5 Analiza rezultata (pogledajte eksperimentalne upute za svaki instrument za podešavanje)
Nakon reakcije spremite rezultate.Nakon analize, podesite početnu vrijednost, završnu vrijednost i vrijednost praga osnovne linije prema slici (korisnik se može prilagoditi prema stvarnoj situaciji, početna vrijednost može se postaviti na 3~15, završna vrijednost može se postaviti na 5~20, podešavanje) u logaritamskom grafikonu Na pragu prozora, linija praga je u logaritamskoj fazi, a krivulja pojačanja negativne kontrole je ravna linija ili ispod linije praga).
6 Kontrola količine（Proceduralna kontrola je uključena u test） Negativna kontrola: Nema očite krivulje pojačanja za FAM, HEX, CY5 detekcijske kanalen
COV pozitivna kontrola: očita krivulja pojačanja FAM i HEX detekcijskih kanala, Ct vrijednost≤32, ali nema krivulje pojačanja CY5 kanala;
Gore navedeni zahtjevi moraju biti ispunjeni istovremeno u istom eksperimentu;u suprotnom, eksperiment je nevažeći i treba ga ponoviti.
7 Utvrđivanje rezultata.
7.1 Ako nema krivulje pojačanja ili vrijednosti Ct> 40 u FAM i HEX kanalima testnog uzorka, a postoji krivulja pojačanja u CY5 kanalu, može se procijeniti da nema novog koronavirusa 2019 (2019-nCoV) RNA u uzorku;
.2 Ako testni uzorak ima očite krivulje pojačanja u FAM i HEX kanalima, a vrijednost Ct je ≤40, može se ocijeniti da je uzorak pozitivan na novi koronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Ako ispitni uzorak ima jasnu krivulju pojačanja samo u jednom kanalu FAM ili HEX, a vrijednost Ct je ≤40, a nema krivulje pojačanja u drugom kanalu, rezultate je potrebno ponovno testirati.Ako su rezultati ponovnog testiranja dosljedni, uzorak se može ocijeniti pozitivnim za novi
koronavirus 2019 (2019-nCoV).Ako je rezultat ponovnog testiranja negativan, može se ocijeniti da je uzorak negativan na novi koronavirus 2019 (2019-nCoV).
Pozitivna vrijednost prosudbe
Metoda ROC krivulje koristi se za određivanje referentne CT vrijednosti kompleta, a referentna vrijednost interne kontrole je 40.
Tumačenje rezultata ispitivanja
1. Svaki eksperiment treba testirati na negativne i pozitivne kontrole.Rezultati ispitivanja mogu se odrediti samo kada kontrole zadovoljavaju zahtjeve kontrole kvalitete
2. Kada su FAM i HEX kanali detekcije pozitivni, rezultat kanala CY5 (interni kontrolni kanal) može biti negativan zbog konkurencije sustava.
3. Kada je rezultat unutarnje kontrole negativan, ako su FAM i HEX kanali za otkrivanje epruvete također negativni, to znači da je sustav onemogućen ili da je operacija pogrešna, t test nije valjan.Stoga je uzorke potrebno ponovno ispitati.
